T h1 /T h2 細(xì)胞因子對心臟移植大鼠NPC 輸注誘導(dǎo)免疫耐受的作用
李玉僑, 孫立江, 張桂銘, 姚如永
(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科, 山東 青島  266003)

[  摘要]      目的  探討大鼠血清中 T h1/ T h2 細(xì)胞因子表達(dá)與供肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞(N PC)輸注誘導(dǎo)心臟移植免疫耐受的關(guān)系。 方法 建立大鼠心臟移植模型, 將 40 只大鼠隨機(jī)分成排斥反應(yīng)組、免疫耐受組, 每組 20 只。 觀察移植心臟存活時間, 并檢測受者血清中 T h1/ T h2 細(xì)胞因子白細(xì)胞介素 2(IL-2)、干擾素γ(IF N-γ)、白細(xì)胞介素 4(IL-4)、白細(xì)胞介素 6(IL-6)、白細(xì)胞介素 10(IL-10)的表達(dá)水平。 結(jié)果  免疫耐受組供心存活時間為(30 .83 ±2 .55)d , 排斥反應(yīng)組為(8 .15±2 .08)d, 差異有顯著性(t =24 .46, P <0 .01)。術(shù)后 7 、14 d 排斥反應(yīng)組血清 T h1 細(xì)胞因子 IL-2、 IFN-γ水平均高于免疫耐受組, T h2 細(xì)胞因子 I L-4、IL-10 表達(dá)水平均低于免疫耐受組, 術(shù)后7 d 血清 I L-6 表達(dá)水平顯著高于免疫耐受組(t =4 .50 ～  16 .20, P <0 .01)。 結(jié)論  免疫耐受的形成與 T h1/ T h2 細(xì)胞因子相互作用有關(guān)。
[  關(guān)鍵詞]      T h1 細(xì)胞;T h2 細(xì)胞;心臟移植;肝細(xì)胞;白細(xì)胞介素類;干擾素Ⅱ 型;免疫耐受
[  中圖分類號]      R654.28        [  文獻(xiàn)標(biāo)志碼]      A        [  文章編號]      1672-4488(2011)05-0399-04
THE EFFECTS OF Th1/ Th2 CYTOKINES ON NPC-INFUSION-INDUCED IMMUNE TOLERANCE IN HEART-TRANSPLANTED
RATS    LI YU-QI AO ,  S U N  LI-J I A NG ,  Z H A NG GU I-MI NG ,  Y AO RU-Y O NG    (Department of  Urology ,  T he Affiliated  Hos- pital of Qingdao University  M edical Collage ,  Qingdao  266003 ,   Chin a)
[ ABSTRACT] Ob jective T o s tudy the relation ship betw een T h1/ Th 2 cy tokine expression in serum and im mune tolerance , induced by  non-parenchymal cells (N PC)of donated  liver ,  of cardiac allografts  in  rats.   Methods    A m odel of h eart t ransplant a- t ion  w as  created  in 40  rats ,  and evenly  randomiz ed to rejection  group and immu ne-t olerance group .T he su rvival t ime of th e im plan- ted heart w as ob served ,  the  exp ressions  of serum  Th1/ Th2  cy tokin es :in terferon-γ(IFN-γ),  interleukin-2 (IL-2),   interleu kin-4 (I L-4),  interleukin-6 (IL-6)and  interleu kin-10 (IL-10),  w ere measu red .   Results    T he survival t ime  of  heart allografts  in  tole rance group  was (30 .83 ±2 .55)d ,   and that in  rejection  g rou p w as (8 .15 ±2 .08)d ,   the  di ff erence being  significant  betw een  the tw o  groups (t =24 .46 , P <0 .01).Seven  and  14  days  after  t ran splantation ,   the expression  of  Th 1  cytokines (IL-2 ,   IFN-γ)w ere m uch  high er  in  rejection  group  th an  in  immu ne-t olerance g rou p ,  and  that  of T h2 cytokines (IL-4 ,  IL-10)w ere low er.Seven  day s after  surgery ,   th e exp ression  of  IL-6  in  rejection  group  w as  mu ch  higher  than  imm une-t olerance g rou p (t =4 .50 -16 .20,  P < 0 .01).Conclus ion     Th e formation  of immune  tolerance is associated w ith  interaction  of T h1/ Th 2 cy tokines.
[ KEY WORDS]     Th 1 cells ;T h 2 cells ;heart  t ransplan tation ;hepatocy te ;in terleu kins ;int erferon type  Ⅱ ;immu ne tolerance

隨著醫(yī)學(xué)診療技術(shù)的發(fā)展, qi官移植已成為終末期qi官衰竭病人的*治療方法, 而移植后免疫排斥反應(yīng)阻礙了qi官移植廣泛開展。誘導(dǎo)機(jī)體抗原特異性免疫耐受, 是解決qi官移植排斥的根本方法。已有研究認(rèn)為, Th1 與 Th2 兩類輔助性 T 細(xì)胞的相互作用與免疫耐受形成有關(guān)[ 1]  。本研究通過肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞(N PC)誘導(dǎo)心臟移植免疫耐受的模型, 探討 Th1/ Th2 細(xì)胞因子在誘導(dǎo)免疫耐受中的作用。
1 材料與方法
1 .1 材料
實(shí)驗(yàn)用 8 ～ 12 周齡、體質(zhì)量為 200 ～ 250 g 的健

[ 收稿日期] 2011-01-16 ; [ 修訂日期] 2011-03-21
[ 作者簡介]   李玉僑(1985-), 男, 碩士研究生。
[ 通訊作者]   孫立江(1963-), 男, 博士, 主任醫(yī)師, 碩士生導(dǎo)師。
康封閉群雄性SD 大鼠及 Wistar 大鼠, 由青島派特福德白鼠養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供, Lew is 大鼠由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供。Collag enase Ⅱ 、蛋白酶 E 、D nase  Ⅰ 、二甲基亞砜(D MSO)購自 Sigm a 公司, RPM I 1640 及淋巴細(xì)胞分離液購自Solarbio 公司, 無支原體胎牛血清由杭州四季青生物工程材料有限公司提供, si裂霉素 C 由 Ro che 公司提供。大鼠白細(xì)胞介素 2(IL-2)、干擾素 γ(IFN- γ)、白細(xì)胞介素 4(IL-4)、白細(xì)胞介 6(I L-6)、白細(xì)胞介素 10(IL-10)試劑盒由上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司提供。
1 .2    模型的建立及分組
SD 大鼠為供體, Wistar 大鼠為受體。頸部心臟移植模型建立具體方法參照文獻(xiàn)[ 2] 并進(jìn)行改進(jìn)。將供者心臟的主動脈與受者的頸總動脈、供者心臟
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的肺動脈與受者的頸外靜脈行端端吻合。供心血液循環(huán)途徑為:受體頸總動脈-供心主動脈-冠狀動脈- 冠狀靜脈-右心房-右心室-肺動脈-受體頸外靜脈 。手術(shù)成功標(biāo)準(zhǔn):供心再灌注后顏色鮮紅, 收縮有力, 吻合口無滲血, 存活 72 h 以上。
將 40 只大鼠隨機(jī)分為排斥反應(yīng)組(A 組)和免疫耐受組(B 組), 每組 20 只。術(shù)中及術(shù)后由于血栓形成 、窒息 、移植時間過長、移植心臟停搏等原因失敗5 只, 其中A 組2 只, B 組 3 只。A 組經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水 1 m L , 7 d 后行 SD ※Wistar 大鼠頸部心臟移植 ;B 組術(shù)前 7 d 經(jīng)尾靜脈注射 Wistar 大鼠 NPC 2 ×10  個(1 m L)。
1 .3 NPC 懸液的制備
參照張燕華等[ 3] 所報道的方法。經(jīng)門靜脈插管用 D-H anks 液原位灌注后無菌取下肝臟, 剪碎, Ⅱ 型膠原酶消化, 過 200 目鋼si網(wǎng)制成細(xì)胞懸液, 再以蛋白酶E 、D nase Ⅰ消化并離心, 用RPM I 1640 培養(yǎng)液清洗后獲得的細(xì)胞即為NPC 。錐蟲藍(lán)拒染法鑒定活細(xì)胞數(shù)>95   。
1 .4 檢測指標(biāo)和方法
1 .4 .1    移植心臟平均存活時間(MS T)  移植心觸診判斷是否存活, 每日頸部心臟觸診, 記錄移植物存活和排斥反應(yīng)發(fā)生的時間。以供心增大、停止搏動作為排斥反應(yīng)的終點(diǎn)。存活時間從移植當(dāng)天統(tǒng)計至 失活前 1 d 。
1 .4 .2    混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(M LR)  輸注 NPC  7 d
后兩組各取大鼠 5 只, 分別測定其對供體大鼠及第三品系Lew is 大鼠的M LR 。A 組及B 組大鼠淋巴細(xì)胞為反應(yīng)細(xì)胞, 供體及 Lew is 大鼠淋巴細(xì)胞為刺激細(xì)胞。
1 .4 .2 .1    供體淋巴細(xì)胞的制備  參照文獻(xiàn)[ 4-5]  ,
即從大鼠脾中分離出單個核細(xì)胞, si裂霉素C 處理后用含體積分?jǐn)?shù) 0 .10 胎牛血清的 RPM I 1640 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為 2 ×109 / L 。
1 .4 .2 .2    反應(yīng)細(xì)胞的制備  從大鼠脾中分離出單個核細(xì)胞, 用含體積分?jǐn)?shù) 0 .10 胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為 2 ×10 / L 。錐蟲藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活率均>95    。
1 .4 .2 .3    混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)  參照文獻(xiàn)[ 4-5]  , 取
上述細(xì)胞各 50 μL   分別按如下分組加入 96 孔板, 置
37  ℃、體積分?jǐn)?shù) 0 .05  CO 2   培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5  d 。1組:SD 大鼠單個核細(xì)胞 50 μL +A 組大鼠單個核細(xì)胞 50 μL ;2 組 :SD 大鼠單個核細(xì)胞 50 μL +B 組大
鼠單個核細(xì)胞 50 μL ;3 、4 組以 Lewis 大鼠單個核細(xì)胞作為刺激細(xì)胞, 每組設(shè)3 個復(fù)孔。終止培養(yǎng)前 4 h , 每孔加M TT  20 μL 。終止培養(yǎng)后, 吸棄培養(yǎng)液, 每孔加DMSO 150 μL , 待結(jié)晶*溶解后, 在酶標(biāo)分析儀上測定 490 nm 處 A 值。以刺激指數(shù)(SI)判斷細(xì)胞活性高低 :SI =實(shí)驗(yàn)孔 A 值/ 對照孔 A 值。
1 .4 .3    Th1/ Th2 細(xì)胞因子  心臟移植后 7 、14 d ,分別采集各組受體大鼠尾靜脈血, 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血清IL-2 、IF N-γ、I L-4 、IL-6 、I L-10 的水平。按試劑盒說明操作。
1.5    統(tǒng)計學(xué)處理
采用SPSS 17 .0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理, 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 x ±s 表示, 組間比較采用 t 檢驗(yàn)。
2結(jié) 果
2 .1    M ST
A 組MS T 為(8 .15 ±2 .08)d , B 組為(30 .83 ±
2 .55)d , 兩組比較差異有顯著意義(t =24 .46 , P <
0 .01)。
2 .2    受者大鼠血清中 Th1/ Th2 細(xì)胞因子的表達(dá)
術(shù)后 7 、14 d , B 組血清中T h1 細(xì)胞因子I L-2 和IFN-γ表達(dá)水平較 A 組明顯下降, Th2 細(xì)胞因子IL-4 、IL-10 表達(dá)水平較A 組明顯上升, 術(shù)后 7 d 血清IL-6 表達(dá)水平較A 組明顯下降, 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t =4 .50 ～ 16 .20 , P <0 .01)。見表 1 。
2.3    M LR
在NPC 輸注 7 d 后, B 組SI 值(3 .97 ±0 .33)較 A 組(7 .09 ±0 .25)顯著降低(t =17 .00 , P <0 .01);
第三品系Lew is 大鼠脾細(xì)胞作為刺激細(xì)胞時, B 組SI 值(7 .36 ±0 .31)與 A 組(7 .51 ±0 .70)比較差異無顯著性(t =0 .45 , P >0 .05)。
3討 論
供者特異性抗原能誘導(dǎo)受體產(chǎn)生免疫耐受并促進(jìn)移植物存活已有較多報道[ 6-9] 。本實(shí)驗(yàn)在未應(yīng)用免疫抑制劑的情況下, 術(shù)前 7 d 給予受體大鼠尾靜脈輸注供體NPC 后, 行頸部心臟移植, 結(jié)果顯示, 免疫耐受組供心存活時間較免疫排斥組明顯延長, 說明NPC 成功誘導(dǎo)了免疫耐受, M LR 證實(shí)這種免疫耐受為供體特異性的。那么 NPC 是如何誘導(dǎo)免疫耐受的?
STA RZEL 等[ 10]  提出的“ 微嵌合體學(xué)說”和“ 雙
向移植排斥”理論,   可能是移植免疫耐受誘導(dǎo)和維持
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