凍存技術(shù)

    1. 液氮法

    目前，細(xì)胞凍存zui常用的技術(shù)是液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護(hù)劑的緩慢冷凍法凍存細(xì)胞。細(xì)胞冷凍技術(shù)的關(guān)鍵是盡可能地減少細(xì)胞內(nèi)水分，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。人ELISA試劑盒采用或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可以使冰點(diǎn)下降，提高細(xì)胞膜對水的通透性，且對細(xì)胞無明顯毒性。慢速冷凍方法又可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，人ELISA試劑盒減少胞內(nèi)形成冰結(jié)晶的機(jī)會，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。

    常用的細(xì)胞冷凍貯存器為液氮貯存器，規(guī)格有35L3和50L3兩種。

    細(xì)胞凍存時常備的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%～20%的血清培養(yǎng)液，DMSO（分析純）或無色新鮮（121°C蒸氣高壓消毒），2mL安瓿（或細(xì)胞凍存管）、吸管、離心管、噴燈、紗布袋（或凍存管架）等。

    主要操作步驟為：

    （1）選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，在凍存前一天換液。將多個培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。適時去掉胰蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液。用吸管吸取培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，使其成為均勻分散的細(xì)胞懸液。懸浮生產(chǎn)細(xì)胞則不要消化處理。然后將細(xì)胞收集于離心管中離心（1000r/min，10分鐘）。

    （2）去上清液，加入含20%小牛血清的*培養(yǎng)基，于4℃預(yù)冷15分鐘后，逐滴加入已無菌的DMSO或，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，細(xì)胞濃度為3×106～1×107/mL之間。

    （3）將上述細(xì)胞分裝于安瓿或冷凍塑料管中，安瓿裝1～1.5mL在火焰噴燈上封口，封口處要*封閉，圓滑無勾。冷凍管要將蓋子蓋緊，并標(biāo)記好細(xì)胞名稱和凍存日期，同時作好登記（日期、細(xì)胞種類及代次、凍存支數(shù)）。

    （4）將裝好細(xì)胞的安瓿或凍存管裝入沙布袋內(nèi)；置于液氮容器頸口處存放過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮中。采用控制降溫速度的方法也可采用下列步驟：先將安瓿置入4℃冰箱中2～3小時，再移至冰箱冷凍室內(nèi)3～4小時（此步可省略），再吊入液氮容器頸氣態(tài)部分存放2小時，zui后沉入液氮中。

    2. 分布降溫法

    細(xì)胞系凍存程序：

    1） 單層細(xì)胞的消化。將經(jīng)24~48小時培養(yǎng)已長成單層的傳代細(xì)胞培養(yǎng)物棄去生長液，加適量ATV，1~2分鐘后倒棄ATV，再加入少量ATV液，經(jīng)0.5～1分鐘倒去ATV，室溫或37oC溫箱作用2~3分鐘，視細(xì)胞解離情況，拍打細(xì)胞培養(yǎng)瓶。使單層細(xì)胞*解離。SP2／0瘤細(xì)胞，待生長好后用吸管吹打，再經(jīng)1 000轉(zhuǎn)／ 分離心lO分鐘。

    2） 離心洗滌：向培養(yǎng)瓶內(nèi)加5~1 0m1預(yù)冷的MEM使細(xì)胞懸浮，人ELISA試劑盒再將其吸出置滅菌離心管中，以1 000rpm 離心8～10分鐘后棄去上清液。

    3） 細(xì)胞懸液的制備：向離心管內(nèi)逐滴緩慢加入預(yù)冷的凍存保護(hù)液，使細(xì)胞濃度為150~400萬／ml，然后迅速分裝于安瓿瓶中，每瓶加量為lml。

    4） 致冷凍結(jié)：將安瓿瓶放入帶有棉墊的紙盒或塑料盒內(nèi)，直立置不同條件下致冷凍結(jié)果保存：

    a、4oC兩小時后移至一2OoC作用2小時，再移入一4OoC4小時后在一7OoC下24小時投入液氮。

    b， 一20oC4小時后移致一4OoC。C經(jīng)4小時移人一7OoC冰箱24小時，投入液氮。

    c， 一4OoC4小時后移入一70oC24小時后投入液氮。

    d、一20oC4小時后移入一70oC經(jīng)24小時后投入液氮中。

    e、一70oC24小時后投入液氮中。

    5） 液氮中保存：將凍結(jié)后的安瓿裝入預(yù)冷的小布袋中，投入液氮。為防止安瓿漂浮，可預(yù)先在小布袋中加入幾塊小卵石。

    3. 玻璃化法

    玻璃化保存（Vitrification）是一種超速冷凍方法。它是以極快的速度冷凍細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)外的游離水迅速形成玻璃樣物質(zhì)，而不形成冰晶。人ELISA試劑盒這種保存方法既避免了由于慢速降溫時導(dǎo)致的鹽濃度升高，又防止了由于冰晶形成造成的物理損傷，可獲得較高存活率。

    玻璃化首先由Luyet在1937年提出，他認(rèn)為生命是生物活體系統(tǒng)的原子或其他結(jié)構(gòu)元的一種特殊排列．并且輕微的排列位置擾動就會破壞平衡從而導(dǎo)致死亡，而結(jié)冰時的驅(qū)動力會破壞這種特殊的排列，這就是冰凍死亡的原因。玻璃

    化比凍結(jié)固化方法引起的結(jié)構(gòu)變化要小，因而是一種較理想的低溫保存途徑。

    1981年，F(xiàn)ahy首先明確提出，用高濃度的低溫保護(hù)劑溶液，可在較慢地冷卻速率以及高壓條件下實(shí)現(xiàn)*的玻璃化，以后又發(fā)展了一些所謂“玻璃化溶液”，使細(xì)胞、組織乃至器官等范圍廣泛的生物系統(tǒng)玻璃化低溫保存成為可能。

    1985年，Rail和Fahy[ 目用這種玻璃化溶液使鼠胚胎玻璃化保存獲得成功，是這種技術(shù)走向?qū)嵱没耐黄啤?br />復(fù)蘇技術(shù)

    1. 細(xì)胞復(fù)蘇的原則

    在實(shí)際操作中，凍存細(xì)胞要進(jìn)行復(fù)蘇，再培養(yǎng)傳代。復(fù)蘇細(xì)胞一般采用快速融化法。以保證細(xì)胞外結(jié)晶快速融化，以避免慢速融化水分滲入細(xì)胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細(xì)胞。

    2. 細(xì)胞復(fù)蘇的主要操作步驟

    （1）佩戴眼鏡和手套，從液氮罐中取出安瓿或冷凍管。

    （2）迅速放入38℃水浴中，并不時搖動，在1分鐘內(nèi)使其*融化，然后在無菌下取出細(xì)胞。

    （3）在1000r/min速度下離心5～10分鐘，棄去上層液，加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中，接種濃度1×109/L，置37℃溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長情況。若細(xì)胞密度較高，及時傳代。或無需離心直接將細(xì)胞加入瓶中，并加入培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)12～24小時后，充去上清，換入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

    3. 注意事項(xiàng)

    在細(xì)胞復(fù)蘇操作時，應(yīng)注意融化凍存細(xì)胞速度要快，人ELISA試劑盒可不時搖動安瓿或冷凍管，使之盡快通過zui易受損的溫度段（-5～0℃）。這樣復(fù)蘇的凍存細(xì)胞存活率高，生長及形態(tài)良好。然而，由于凍存的細(xì)胞還受其他因素的影響，有時也會有部分細(xì)胞死亡。人ELISA試劑盒此時，可將不貼壁、飄浮在培養(yǎng)液上（已死亡）的細(xì)胞輕輕倒掉，再補(bǔ)以適量的新培養(yǎng)液，也會獲得較為滿意的結(jié)果。