ELISA技術(shù)操作要點，酶和底物

ELISA中所用的酶要求純度高、催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高、專一性強、性質(zhì)穩(wěn)定、來源豐富、價格不貴、制備成的酶標抗體或抗原性質(zhì)穩(wěn)定，繼續(xù)保留著它的活性部分和催化能力。在受檢標本中不存在與標記酶相同的酶。另外它的相應(yīng)底物應(yīng)易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定，光吸收高。ELISA中zui常用的酶為辣根過氧化酶（HRP）和從牛腸粘膜或大腸桿菌提取的堿性磷酸酶（AP）。

HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，純化方法也不復雜。它是一種糖蛋白，含糖量約18％；分子量為44kD；是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成的一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為無色糖蛋白，在275nm波長處有zui高吸收峰；輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，在403nm波長處有zui高吸收峰。

ELISA技術(shù)操作要點，結(jié)合物

酶標記的抗原或抗體稱為結(jié)合物（conjugate）。抗原由于化學結(jié)構(gòu)不同，可用不同的方法與酶結(jié)合。如為蛋白質(zhì)抗原，基本上可參考抗體酶標記的方法。制備抗體酶結(jié)合物的方法通常有以下幾種。

1．戊二醛交聯(lián)法戊二醛是一種雙功能團試劑，可以使酶與蛋白質(zhì)或其他抗原的氨基通過它而偶聯(lián)。戊二醛交聯(lián)可用一步法（如連接AP），也可用二步法（如連接HRP）。舉例如下：

2～5mg純抗體與5mgAP混合于0.1mol/LpH6.8的磷酸緩沖液1ml中，4℃下對同上緩沖液透析平衡。磁力攪拌下，緩慢加入1％戊二醛0.05ml，在室溫下放置2小時。在4℃下對0.05mol/LpH8.0Tris緩沖液透析平衡，即得酶標抗體。

辣根過氧化物酶可溶解于50％飽和度硫酸銨中。用上法交聯(lián)后可用50％飽和度硫酸銨沉淀酶標抗體，棄去上清中游離酶。

戊二醛一步法操作簡便、有效，而且重復性好。缺點是交聯(lián)時分子間的比例不嚴格，大小也不一，影響效果。

制備HRP抗體結(jié)合物也可用二步法，即先將HRP與戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5緩沖液中再與抗體作用而形成酶標抗體。此法的效率可高于一步法10倍左右。

2．過碘酸鹽氧化法本法只用于HRP的交聯(lián)。該酶含18％碳水化合物，過碘酸鹽將其分子表面的多糖氧化為醛基。用硼氫化鈉（NaBH4）中和多余的過碘酸。酶上的醛根很活潑，可與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成按摩爾比例結(jié)合的酶標結(jié)合物。有人認為此法為辣根過氧化物酶交聯(lián)zui有效的方法。但也有只認為由于所用試劑較為劇烈，各批實驗結(jié)果不易重復。